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N310全自動凱氏定氮儀廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質含量測定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。其測定原理相同,主要區別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實驗規模小，實驗費用低的優點。但微量法的準 確度和精密度比常量法要差一些。國家標準規定為半微量凱氏定氮法。凱氏定氮法整個測定過程分為消解、蒸餾、滴定三步。要使測定結果有更好的正確度、準確度和精準度,采用高效的方法和認真細致掌握測定的每個步驟、各個細節及相應的注意事項,就顯得尤為重要。本文就此進行深入的探討。

1. 原理 

蛋白質是含氮的有機化合物。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質分解,分解生成的胺基與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數, 即為蛋白質含量。

1.1 消化

有機物中的胺基在強熱和CuSO4、濃H2SO4作用下,消化生成(NH4)2SO4,反應式為:2NH-2+ H2SO4+2H+=(NH4)2SO4(其中CuSO4做催化劑)

1.2 蒸餾

在凱氏定氮器中與堿作用,通過蒸餾釋放出NH3,收集于H3BO3溶液中,反應式為:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 

1.3 滴定

用已知濃度的H2SO4 (或HCI)標準溶液滴定,根據H2SO4(或HCI)消耗的量計算出氮的含量,然后乘以相應的換算因子,即得蛋白質的含量,反應式為: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

依據凱氏定氮法,通過全自動凱氏定氮儀測定樣品中氮或粗蛋白的方法已得到廣泛的認可和使用,以下是自動凱氏定氮儀測定魚粉和豆粕中粗蛋白含量的實驗。

2. 實驗過程

2.1主要試劑的配制40%氫氧化鈉:化學純400g氫氧化鈉溶于1000mL無氨蒸餾水中;2%硼酸:分析純20g硼酸溶于1000mL無氨蒸餾水中;0.1mol/L鹽酸:分析純8.3mL鹽酸定容至1000mL,通過無水碳酸鈉標定;混合指示劑:把溶解于95%乙醇的0.%l溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.1%l甲基紅溶液1份混合而成。

2.2 實驗儀器

N310全自動凱氏定氮儀;樣品消化爐DS-360石墨消解儀;廢氣吸收裝置。

2.3實驗過程

稱取約0.2g樣品放入消解管,催化劑硫酸銅和硫酸鉀按1:15質量比例混合加入3.2g,量取10mL左右濃硫酸慢慢搖動將樣品浸濕。放入DS-360石墨消解儀,通過曲線加熱升溫至420e,消化1h,樣品呈透明藍綠色液體,繼續消化20min消解完成。提升消煮管冷卻,消解的樣品放入格丹納N310全自動凱氏定氮儀,關閉安全門,設置參數后儀器自動進行蒸餾、吸收、滴定、計算并打印結果。DS-360石墨消解儀的消解溫度設置如下:

(1)消化不易起泡的樣品,可選擇直線加熱,預加溫度設為380e,消化2h即可。

(2)若易起泡的樣品需采用曲線分段加熱

2.4測定結果

樣品測定結果見表1。

所得實驗結果達到分析要求,完全符合有關國標GB/T6432-94。

3.實驗過程注意事項討論

(1)樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻,液體樣品應振搖或攪拌均勻。固體樣品一般取樣范圍為0.20~2.00g;半固體試樣一般取樣范圍為2.00~5.00g;液體樣品取樣10.0~25.0mL(約相當氮30~40mg)。若檢測液體樣品,結果以g/100mL表示。

(2)樣品放入定氮管內時,不要沾附管頸上。

萬一沾附可用少量水沖下,以免樣品消化不完全,結果偏低,或者用濾紙包裹好一起投入消化,濾紙影響通過空白扣除。若樣品不易消化至澄清透明,可將消化液稍冷卻,加入數滴過氧化氫后,再繼續加熱消化至完全。

(3)消化時,不要用強火。應注意消化溫度,用消解儀最好選擇曲線加熱,防止劇烈反應導致樣品上沖附著在瓶壁上難以徹底消化。若樣品含糖高或含脂較多時,注意控制加熱溫度,以免大量泡沫噴出,造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟,或硅消泡劑減少泡沫產生。在整個消化過程中保持和緩的沸騰,使火力集中在消化管底部,以免附著在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。采用格丹納公司消解爐DS-360石墨孔內加熱,階段升溫能夠很好地解決此問題。

(4)如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這樣會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用。因此,當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作用是升高溶液的沸點;催化劑硫酸銅在有機物全部消化后,溶液顯清澈透明的藍綠色,可用它來指示消化終點。此外,硫酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應的指示劑。過氧化氫為氧化劑,有助于有機物消化,同時可以消除消化 過程中的氣泡現象。

(5)向消化管中加入濃堿時,往往出現褐色沉淀物,這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應,生成氫氧化銅,經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用,生成深藍色的結合[Cu(NH3)4]2+,加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個測定的順利進行。由反應原理可知,當氫氧化鈉足量時有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色；當氫氧化鈉量不足時就無黑色氧化銅產生而使溶液呈淡藍色,所以有無氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標志。

(6)實驗過程中,因蒸餾時反應室的壓力大于大氣壓力,故可將氨帶出。所以,蒸餾時,蒸氣要發生均勻,充足,蒸餾中不得停火斷氣,否則, 會發生倒吸。傳統凱氏實驗中,停止蒸餾時,由于反應室外層的壓力突然降低,可使液體倒吸入反應室外層,所以,操作時,應先將冷凝管下端提離液面并清洗管口,再蒸一分鐘后關掉熱源。蒸餾是否完全,可用精密pH試紙測冷凝管口的冷凝液來測定,中性則說明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法,因為如果蒸餾失敗的話,半微量法還可繼續蒸餾,而常量法只好全部重來,費時費力。

4.結論

凱氏定氮法作為目前的國標方法與我們的工作密不可分,本文主要結合凱氏定氮儀測定樣品的具體實驗討論了凱氏定氮法操作的細節及注意事項;同時采用自動凱氏定氮儀法測定粗蛋白,操作簡單,快捷,高效,安全可靠,一次性可消化20個樣品,只需2~3h。蒸餾滴定一個樣品僅需5min左右便可得出結果,適用于批量樣品的測定。使用自動凱氏定氮儀測定氮及粗蛋白具有高的精密度和準確性,對食品、飼料中的蛋白質測定具有較強的實用性和可行性。